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这幅《蒙娜丽莎》是普拉多国家博物馆馆藏中最具历史价值的特色作品之一。研究发现，该画作与卢浮宫所藏的原版《蒙娜丽莎》绘制于同一时期，且由达·芬奇工作室的成员在他本人的指导下绘制而成。该画作早在17世纪就被列入西班牙皇家藏品清单，后于1819年随着普拉多国家博物馆的成立被收入馆藏欧洲杯竞猜官方销售时间，并一直陈列在普拉多的展厅内。

2011年，为了将这幅《蒙娜丽莎》出借至法国卢浮宫参加次年的达·芬奇主题展览，普拉多国家博物馆对其进行了修复与研究，发现在深色背景下还隐藏着一层风景画，此次修复使长久以来被掩盖的画面得以显露。人们还发现普拉多版《蒙娜丽莎》在绘制过程中与卢浮宫的原版有着许多惊人的同步之处。目前，该画作被视为还原达·芬奇工作室创作过程的重要线索之一。