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这幅《蒙娜丽莎》是普拉多国家博物馆馆藏中最具历史价值的特色作品之一。研究发现，该画作与卢浮宫所藏的原版《蒙娜丽莎》绘制于同一时期，且由达·芬奇工作室的成员在他本人的指导下绘制而成。该画作早在17世纪就被列入西班牙皇家藏品清单，后于1819年随着普拉多国家博物馆的成立被收入馆藏，并一直陈列在普拉多的展厅内。

2011年，为了将这幅《蒙娜丽莎》出借至法国卢浮宫参加次年的达·芬奇主题展览欧洲杯竞猜中奖彩票，普拉多国家博物馆对其进行了修复与研究，发现在深色背景下还隐藏着一层风景画，此次修复使长久以来被掩盖的画面得以显露。人们还发现普拉多版《蒙娜丽莎》在绘制过程中与卢浮宫的原版有着许多惊人的同步之处。目前，该画作被视为还原达·芬奇工作室创作过程的重要线索之一。